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CULTIVO DE Bacillus subtilis CEPA QST 713

15 febrero, 201715 febrero, 2017| Luis Valera MonteroLuis Valera Montero| 2 comentarios | 6:42 pm
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CULTIVO DE Bacillus subtilis CEPA QST 713 EN REACTOR TIPO AIRLIFT Y SU ACTIVIDAD ANTAGÓNICA CONTRA Phytophthora capsici.

RESUMEN.

La producción y calidad de chile se ve limitada por diversas enfermedades causadas por hongos como Phytophthora capsici. Su control químico implica altos costos económicos y ambientales. Por lo que una alternativa para el manejo del hongo es el control biológico con Bacillus subtilis.

Derivado de esto, el objetivo de esta investigación fue determinar el porcentaje de inhibición in vitro de B. subtilis contra el fitopatógeno P. capsici  en diferentes medios de cultivo líquidos para establecer la factibilidad biológica en un reactor artesanal tipo airlift.

El ensayo in vitro se hizo en cajas Petri, usando como medio de cultivo PDA, la cepa QST713 de B. subtilis y el hongo P. capsici. Se evaluaron medios de cultivos líquidos (caldos nutritivos), en matraces Erlenmeyer con 200 mL de agua, en un diseño completamente al azar con 8 tratamientos y 6 repeticiones: T1, almidón de arroz; T2, almidón de maíz; T3, almidón de trigo; T4, Peptona + azúcar morena; T5, glucosa más fructuosa; T6, glucosa + almidón de maíz + almidón de arroz + almidón de trigo; T7, peptona + azúcar morena +almidón de maíz, arroz y trigo; T8, peptona + azúcar morena + glucosa + almidón de maíz, arroz y trigo.

Se construyó el reactor air lift y se evaluó la curva de crecimiento de B. subtilis durante 24 horas. Los resultados obtenidos mostraron que la bacteria tuvo un 64 % de efectividad en la inhibición del hongo.

El medio de cultivo de almidón de trigo mostro efecto significativo (Tukey, α=0.05) con respecto al crecimiento de la bacteria, donde  después de 5 horas fue > 1×109 UFCs, considerado como adecuado para la producción de B. subtilis.

INTRODUCCIÓN

El hongo Phythophtora capsici causa la enfermedad conocida como pudrición basal del  tallo  1,2   en  plantas  de  chile  y  jitomate principalmente, se caracteriza por la pudrición   de   raíces,   tallos,   marchitez    y muerte de plantas; llegando a ocasionar pérdidas del 60 al 100 % en las regiones productoras  de  México. 

La  enfermedad  se presenta en áreas tropicales y subtropicales  e infecta raíces, tallos, hojas y frutos, siendo una de las enfermedades más destructivas a nivel mundial. Debido a la naturaleza persistente del inóculo en el suelo, la estrategia para el control de este patógeno requiere un programa de manejo integrado. Las medidas de control químico y cultural no siempre logran disminuir el daño del hongo, formado por zoosporas con alta movilidad en el suelo. Además, los fungicidas y  fumigantes presentan un alto costo de aplicación,     potencial      daño     ambiental, toxicidad y resistencia del hongo.

Una alternativa que se ha desarrollado en los últimos años, para el manejo del hongo es el control biológico dentro del cual destacan bacterias del género Bacillus, dadas sus potencialidades en la inhibición de fitopatógenos   de   suelos   y   promoción de crecimiento de las plantas 7, así como los hongos   de   los   géneros   Trichoderma     y Xylaria, cuyo uso ha reducido el desarrollo del hongo en más del 40 %.

En el caso particular de las bacterias, Bacillus subtilis ha mostrado alta capacidad para inhibir el crecimiento y esporulación de una amplia gama de hongos fitopatógenos, asociado a

  • 1) parasitismo directo;
  • 2) producción de antibióticos extracelulares como bacilomicina, iturina, micosubtilina y zwittermicina;
  • 3) producción de enzimas líticas como quitinasa, proteasa, β-1,3 glucanasa y celulosa;
  • 4) competencia  por  los nutrientes  en  el  hospedante,  que  causa estrés por nutrientes e inanición en el hongo en germinación y
  • 5) estimulación de defensas del hospedante a través de la resistencia sistémica inducida por medio de la ruta del ácido jasmónico.

De lo anterior, se planteó el objetivo de determinar el porcentaje de inhibición in vitro de B. subtilis contra el fitopatógeno P. capsici en diferentes medios de cultivo líquidos para establecer la factibilidad biológica de un reactor artesanal tipo airlift

MATERIALES Y MÉTODOS

Antagonismo: Para determinar el porcentaje de inhibición de B. subtilis contra P. capsici, en el laboratorio de biotecnología del Instituto Tecnológico El Llano (ITEL) se obtuvo la bacteria del cepario de este plantel; el hongo fue donado por el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) de Celaya, Guanajuato.

Se prepararon 6 cajas Petri con medio de cultivo PDA, se inoculó por punción con B. subtilis a una distancia de 1,5 cm del borde de la placa Petri y el hongo fitopatógeno en  el lado opuesto a la misma distancia, manteniendo entre ambos una  distancia   de 6 cm 8. Una vez establecidas las confrontaciones se incubaron en un cepario donde  la  temperatura  fue  de  25  ±  2     °C durante tres días y se tomaron los valores r1 y r2 para evaluar la efectividad de la inhibición.

Medios de cultivo: Los tratamientos fueron distribuidos en un diseño experimental completamente al azar (DCA), conformado por     8     tratamientos     (caldos   nutritivos) utilizando 6 repeticiones por tratamiento (Tabla 1) 9. Se evaluó el número de UFCs (Unidades   Formadoras   de   Colonias)  24horas después de la inoculación, con base  en la técnica de conteo en placa con diluciones de 1X10-8.

Los datos  obtenidos se sometieron a un análisis de varianza y prueba de comparación de medias de Tukey con α = 0.05. El mejor caldo  nutritivo obtenido en esta fase, se utilizó para su evaluación en el biorreactor airlift.

Biorreactor artesanal airlift: Este tipo de biorreactores en términos generales consta de un tubo vertical transparente. El aspersor se encuentra en la parte inferior de la columna y provee al reactor de pequeñas burbujas que tienen por función el mezclado del líquido y la transferencia de masa de CO2 y la remoción de O2. Entre las ventajas que presentan son su bajo costo, eficiente liberación  de  O2,  área  superficial  mayor en relación al volumen y mezclado  relativamente homogéneo.

Para la presente investigación, se construyó con  los materiales que se mencionan y de acuerdo a lo señalado en la literatura, con algunas modificaciones, de acuerdo a los  objetivos del trabajo.

  • 1 tanque con tapa de 60 litros
  • ½ metro de tubo de cobre
  • ½ metro de tubo PVC
  • 1 m de manguera transparente
  • 1 burbujeador para pecera de 10 a 40 litros de agua
  • 1 segueta para cortar los tubos
  • Alambre para
  • 1 filtro
  • Algodón

Una vez construido, el biorreactor fue esterilizado y llenado con el medio de cultivo significativamente     diferente,    previamente esterilizado. Durante 24 horas, se realizó el conteo  de  UFCs,  tomando  muestras  cada hora, desarrollando diluciones decimales hasta llegar a 1X10-8 las cuales  se  inocularon  en  cajas  Petri  con  medio  PDA, sembrando cinco cajas en cada muestreo, se incubaron y contaron las colonias con la ayuda de un estereoscopio. Con los datos obtenidos se hizo un análisis de regresión lineal en el programa estadístico SAS 9.0

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se ha establecido que un porcentaje de inhibición mayor o igual al 50 % del antagonista contra el fitopatógeno, es un buen  indicador  del  antagonismo  que existe entre ambos organismos 11, los resultados obtenidos    en    la    presente   investigación mostraron un 64 % de inhibición, que indica un buen antagonismo, es decir que B. subtilis inhibe la presencia del fitopatógeno, lo cual permitiría bloquear el acceso de éste hacia la planta. Cabe señalar que B. subtilis, tiene mucho mayor inhibición que Bacillus firmus cuya   actividad   reduce   sólo   en   40   % la incidencia de la enfermedad 12. De  tal manera  que,  la  actividad  antifúngica  de B. subtilis difiere entre cepas, la cual puede ir del 32 al 78 % 12. La actividad antagónica de Bacillus se ha atribuido a la producción de enzimas líticas, antibióticos y/o metabolitos que pueden generar cambios en la membrana citoplasmática; otro posible mecanismo es la inhibición de la germinación, por competencia de nutrientes

Por otra parte, en el experimento de evaluación de los caldos nutritivos se obtuvieron diferencias significativas entre tratamientos (α = 0.05) para el crecimiento  de las UFCs. El medio de cultivo con mayor número de colonias fue el que contenía almidón de trigo, asociado a que éste es fuente de nitrógeno y carbono necesarios para  el  crecimiento   y  reproducción  de   la bacteria, por su importancia como elementos esenciales para el crecimiento microbiano 11. Por ello, este caldo nutritivo mostró un buen crecimiento y cantidad de UFCs  (Tabla 2).

Los resultados también son acordes a otros experimentos 13, 14, en donde se utilizaron granos de trigo para el crecimiento de bacterias  del  género  Bacillus  debido  a que tienen una gran cantidad de nutrientes para satisfacer el ciclo biológico y un adecuado crecimiento de éstas, en condiciones anaerobias

El uso de harinas como sustituto de medios de cultivo microbiológico ha mostrado efecto favorable en el crecimiento y esporulación de cepas de B. subtilis y hay estudios donde se alcanzaron concentraciones de 1.52 x 1010 UFC mL-1 y 3 x 109 UFC mL-1 con el uso de harina de soya 13, 14, 15. Además en esos trabajos, se señaló que la adición de peptona al medio de cultivo, desfavoreció de manera significativa  la  reproducción  de  la bacteria, comportamiento que también se pudo observar en los resultados del presente trabajo.

Respecto al crecimiento de B. subtilis en el caldo nutritivo en el reactor tipo airlift se obtuvieron resultados que superaron en cinco horas la concentración UFCs reportadas como idóneas para el crecimiento de B. subtilis en otro tipo de biorreactores.

En valores mayores a 1×109 UFCs, ha sido considerado como buena producción, y en la regresión que se desarrolló (Figura 1) se superó en cinco horas; caso contrario en otro tipo de biorreactores donde ocurre en periodos   de   ocho   a   nueve   horas.    Por consiguiente, la base de harina de trigo, la temperatura de incubación de 25 ± 2°C, el  pH de 6.5 y el biorreactor airlift, favorecieron el crecimiento de la bacteria.

 

 

CONCLUSIONES

El porcentaje de inhibición in vitro del   hongo capsici fue del 64 % con el uso de B. subtilis cepa QST713. Además, el medio de cultivo líquido con el mayor crecimiento de B. subtilis fue el preparado con almidón de trigo. Con el biorreactor    artesanal    airlift,  se obtuvieron crecimientos superiores a 1×109 UFCs,         después           de        cinco              horas         de evaluación, lo que lo hace un método viable para el cultivo de B. subtilis cepa QST713.

REFERENCIAS

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  3. Ristaino, J.B., y S.A. Johnston. (1999) Ecologically based approaches to management of Phytophthora blight on bell. Plant Dis. 83: 1080- 1089.
  4. Hausbeck, M.K., y K.H. Lamour. (2004) Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Dis. 88: 1292-1303.
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  7. Ramos, S. R. U.; Gutérrez, S. J. G.; Rodríguez, G. R.; Salcedo, M. S. M.; Hernández, L. C. E.;  Luna, H. A.; Jiménez, B. J. F.; Fraire, V. S. y Almeyda, L. I. H. (2010) Antagonismo de dos ascomicetos contra Phythophthora capsici Leonian, causante de la marchitez del chile (Capsicum annum L.). Rev. Mex. de Fitopatología. 28 (2): 75-86.
  8. Camacho, A.; Giles, M.; Ortegón, A.; Palao, M.; Serrano, B. y Velázquez, O. (2009) Análisis microbiológico de alimentos. 2a edición. Facultad de Química. UNAM. 10
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  10. Lizardi J. M. A. (2011) Biorreactores airlift. En: Contribución al estudio de la hidrodinámica y transferencia simultánea de masa en biorreactores airlift de tres fases: producción de un consorcio microbiano degradador de petróleo. Tesis de doctorado. Universidad Autónoma Metropolitana. México. 8-11 pp
  11. Ramos, G. F. (2014) Cultivo de Bacillus subtilis cepa 105 en bioreactor y su actividad antagonista contra Sclerotinia sclerotiorum. Tesis de maestría. Instituto Politécnico Nacional. Yautepec, Morelos. 53
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De la Revista  de Ingeniería y Tecnologías para el Desarrollo Sustentable

 

2 comentarios sobre «CULTIVO DE Bacillus subtilis CEPA QST 713»

  1. buenos días, mi nombre es Karla Hernández, quería saber si tiene una versión en PDF de este trabajo y si podría facilitármelo. Gracias.

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